Рукописний фонд ХДНБ містить рукописні книги та архівні документи, починаючи з ХІV ст., давньоруські, староукраїнські та іноземні пам’ятки.
Харківська державна наукова бібліотека ім. В. Г. Короленка ― один із найбільших фондоутримувачів пам’яток. Особливо цінними з них є рукописні документи. Серед кириличних рукописів ― пергаментна Службова мінея за грудень (бл.1390-х рр.), списки творів псевдо-Діонісія Ареопагіта 1470–1490-х рр. та Іоанна Лествичника 1479 р., ілюміновані українські рукописи ― списки Євангелія XVI–XVII ст.; козацькі літописи (Літопис Самовидця та ін.) у списках XVII–ХІХ ст. Велику наукову цінність мають найдавніший список Острозького літописця у складі Хронографа (бл. 1620-х рр). та рукописи діячів Острозької академії початку XVII ст.
З великою майстерністю оформлені рукописні книги, створені на західноукраїнських землях: Євангеліє та Апостол з Кам’янки-Струмилової відповідно 1567 та 1570 рр. (нині – м. Кам’янка-Бузька Львівської обл.), Євангеліє з Троянівки кінця ХVІ – початку ХVІІ ст. (тепер у Волинській обл.).
У фонді також зберігається відома українська і білоруська пам’ятка – Апостол з Теслугова – рукописна копія 1593–1594 рр. вільнюського видання Франциска Скорини 1525 року. Автор списку й оздоблення ― священник Єрмоген Яцкович на прізвисько Тихоня. Рамки на аркушах, заставки і кінцівки виконані в оригінальному авторському стилі з використанням елементів українського народного орнаменту.
Серед острозьких рукописів особливу наукову цінність становить збірник, що містить Бесіди на Євангеліє від Іоанна Златоуста, Житіє Марії Єгипетської та фрагменти службових книг, переписані у 1606–1607 рр. Стефаном Смотрицьким (з пам’ятним записом 1622 р.) та невстановленою особою, з коментарями та позначками ― автографами його молодшого брата, Мелетія Смотрицького.
Визначна пам’ятка вітчизняної історичної та суспільно-політичної думки Історія русів репрезентована у списку 1830-х рр., що склав чотири томи. Як відомо, цей твір приписують видатному церковному діячу, проповіднику, педагогу, філософу і письменнику XVIII ст. архієпископу Георгію Кониському. Власником харківський списку був один з його нащадків – український письменник та публіцист О. Я. Кониський.
Серед рукописних збірників історичної тематики привертає увагу пам’ятка іноземного походження – Новий синопсис різних історій від створення світу до сьогодення (зібрання з грецьких хронографів) у перекладі Петрашки Дановича – кириличний рукопис початку 1680-х рр. румунською мовою. Окремі слова і рядки в ньому виконані грецькою, церковнослов’янською і турецькою мовами. Рукопис, що належав видатному молдавському воєначальнику XVII ст. Алєксандру Бухушу, є найдавнішим списком відомої молдавської і румунської історико-літературної пам’ятки. До речі, це єдиний її список, виявлений в Україні.
Крім представленої на цьому сайті колекції українських ірмолоїв ХVІІ – початку ХІХ ст. ― нотних гімнографічних пам’яток, у ХДНБ сформовано і колекцю українських метричних книг кінця ХVІІ–ХІХ ст., зокрема Метрична книга с. Основи за 1778 р. із записом про народження «у Федора Івановича Квітки сина Григорія» ― майбутнього класика української літератури Григорія Квітки-Основ’яненка. Окремі пам’ятки репрезентують східну рукописну традицію. Це малоформатні коранічні збірники ХVІІ–ХVІІІ ст., пергаментні сувої на івриті середини – другої половини ХІХ ст.
У колекціях пам’яток писемності зберігаються західноєвропейські грамоти ХV–ХVІ ст. (найдавніша ― пергаментна 1456 р., латиною), офіційні документи державних і судових органів Польщі ХVІІ–ХVІІІ ст. та Російської імперії ХVІІІ–ХІХ ст. Історико-культурний інтерес становлять рукописи ХVІІІ–ХІХ ст. з колекції письменника Григорія Данилевського.
Рукописне зібрання ХДНБ містить чимало ранніх списків фольклорних, літературно-художніх, наукових і публіцистичних творів, зокрема збірник другої половини ХІХ ст. Галицькі народні пісні, укладений Я. Ф. Головацьким, та список 1839 р. п’єси Я. Г. Кухаренка Чорноморський побит на Кубані; список праці українського історика Миколи Костомарова про перший церковний розподіл, автографічні рукописи польського історика та громадського діяча ХІХ ст. Йоахіма Лєлєвеля.
У бібліотеці зберігаються цінні генеалогічні матеріали, документи з історії церкви, українських монастирів ХVI–ХІХ ст.: документне зібрання харківського Свято-Покровського монастиря ХVIII–ХІХ ст.; підготовлений до друку в середині 1850-х рр. рукопис окремих розділів відомої праці архієпископа Філарета (Д. Г. Гумілевського) Историко-статистическое описаніе Харьковской епархіи; інші матеріали з історії та культури Слобожанщини, серед яких рукописи-автографи письменника і богослова, ректора Харківського колегіуму Андрія Прокоповича, церковного діяча та письменника, єпископа Бєлгородського та Обоянського Іосафа Горленка (середина ХVIII cт.), першого єпископа Харківського Христофора Сулими, відомого освітнього діяча, опікуна Харківського навчального округу графа Северина Потоцького та ін.
У ХДНБ також сформовано 65 особових архівних фондів відомих діячів науки і культури ХХ ст. ― вчених з різних галузей знань, винахідників, письменників, митців. Слід зауважити, що життя і діяльність усіх фондоутворювачів пов’язані з Україною, Слобожанщиною чи Харковом.